一、技艺轮廓空姐 偷拍
RNA pull down施行是用于检测RNA勾通卵白与其靶RNA之间互作的施行妙技。该技艺使用体外转录法标志生物素RNA探针， 与胞浆卵白索取液孵育，变成RNA-卵白质复合物。该复合物可与链亲和素标志的磁珠勾通，从而与孵育液中的其他因素分散。复合物洗脱后，通过Western Blot 施行检测特定的 RNA勾通卵白是否与RNA互相作用，亦可通过质谱检测施行进行未知的互作卵白阻滞。
二、施行计划
本施行技艺无论是探索非编码RNA的分子机制，还是开荒靶向RNA-卵白集会的药物，均能提供要津数据因循，鼓励基础商榷与鼎新医学的清晰。
三、施行经由(一）探针准备
1、PCR扩增计划片断
表2 PCR响应条目
温度（℃）
时辰（s）
踩脚袜 足交轮回数
98
10
31
55
5
72
10
表3 PCR响应体系
全长基因片断的得回，纯化、回收(DNA回收试剂盒，天根：DP214-02 )，以全长片断为模板用sense-F/sense-R和AntiSense-F/AntiSense-R引物PCR扩增获
取正义链和反义链的计划基因，跑1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，90V，30min。
2、胶回收
a.柱均衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入采集管中）加入500µl均衡液BL，
12，000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱再行放回采集管中。
b.将单一的计划DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净EP管中，称取分量。
c.向胶块中加入等体积的溶液PC，50℃水浴舍弃10min驾驭，使胶块充分 融解。
d.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12，000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入采集管中。
e.向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12，000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB2放入采集管中。
f.重迭操作步调
g.将吸附柱CB2放入采集管中，12，000rpm离心2min，将吸附柱置于室温，舍弃3min。8、将吸附柱CB2放入一个新的离心管中，向吸附膜中间位置滴加30μl洗脱缓冲液EB，室温舍弃2min，12，000rpm离心1min，采集DNA溶液。
（二）RNA pull down施行
1、体外转录&生物素标志RNA
a.取一支无RNA酶的EP管，色酷影院加入表2-2的转录体系，37℃孵育35min。
表2-2 转录体系
线性化DNA片断
1ug
Biotin RNA Labeling mix
2µl
10×Transcription buffer
2µl
RNA Polymerase
2µl
补足RNase-free水至20µl
b.取出孵育好的EP管，加入2µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min，除掉DNA。
c.取出上述操作的EP管，加入2µl0.2M EDTA（pH=8.0）绝交响应。
d.取3µg Biotin标志的RNA，加入适量Structure Buffer（10mM Tris pH=7.0，0.1M
KCl，10mM MgCl2），使得RNA变成二级结构。然后将RNA 95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。
2、链霉素亲和磁珠与生物素标志的RNA勾通
e.倒置混匀磁珠，并鼎新30ul磁珠到一个新的EP管中将EP管置于磁力架上静置约1min，进行磁性分散；
f.吸除上清，并加入60ul A液重悬磁珠，然后进行磁性分散；
g.吸除上清，并加入30ul B液重悬磁珠，然后进行磁性分散;
h.吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分散;
i.重迭步调5；
j.吸除上清，并加入30ul 1X RNA Capture Buffer重悬磁珠;
k.加入50pmol 生物素标志的磁珠，并奏乐混匀；
l.室温旋转孵育30min
3、样本前处置
a.用1ml 4℃的RLN 悬浮细胞，冰上孵育５min;
b.1450 ×g， 4 ℃ 离心２min，去上清；
c.用100ul预冷的RLN洗涤１次（不行悬浮千里淀）；
d.用100ul预冷的protein lysis buffer再行悬浮细胞（超声2s停4s；10次）；然后涡旋30s，并奏乐混匀；
e.冰上孵育30min；
f.17000×g， 4℃，离心15min；
g.鼎新上清到一个新的EP管备用。
4、磁珠复合物与卵白勾通
a.把预处置好的磁珠，舍弃到磁力架上进行磁性分散；
b.吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分散;
c.重迭步调2；
d.吸除上清，加入100µL of 1X Protein-RNA Binding Buffer 重悬磁珠；
e.把样本舍弃到磁力架上进行磁性分散；
f.吸除上清，并加入100ul 按下表配制的响应体系的mix重悬磁珠：
序号
试剂
体积（ul）
1
10X Protein-RNA Binding Buffer
10
2
50% glycerol
30
3
细胞裂解液
30
4
Nuclease-free water
30
g.4℃旋转孵育30min；
5、洗涤与洗脱
a.把样本舍弃到磁力架上进行磁性分散；
b.吸除上清，加入100µL 1X wash buffer重悬磁珠；
c.重迭步调1与2两次；
d.把样本舍弃到磁力架上进行磁性分散；
e.吸除上清，加入50ul Elution buffer，重悬磁珠；
f.把样本舍弃到磁力架上进行磁性分散；
g.鼎新上清到新的EP管中，即为pull down 居品；
h.向pull down居品中加入13ul loading buffer，并于滚水中水浴10min
i.居品进行后续质谱检测
四、技艺上风
高特异性
浅显适用性
高灵巧度
多维度分析
五、适用限制
1️⃣非编码RNA功能商榷
2️⃣疾病机制探索
3️⃣病毒-宿主互作领路
4️⃣药物开荒与筛选
六、代表性施行效果
七、提供
1
细胞样品＞4×107；动物组织＞100mg（黄豆粒大小）；植物组织＞5g
2
物种信息及基因信息；如后期进行WB施行需自行提供计划卵白抗体空姐 偷拍